Diagnosen av botulism bygger på identifieringen av Clostridium botulinumtoxinet i laboratoriet och på observation av kliniska symptom, även om de ibland är ospecificerade. Sjukdomen kan i själva verket förväxlas med Guillain-Barré syndrom, poliomyelit, stroke, myasthenia gravis och tick-förlamning.
I mat botulism är bilden av neuromuskulära sjukdomar och intag av potentiellt förorenad mat viktiga ledtrådar. Samtidig manifestation hos minst 2 patienter som åt samma mat förenklar diagnosen. Bekräftelsen erhålls genom isolering av mikroorganismen med odlingstestet av misstänkta matprover eller avföring hos patienten och med identifiering av botulinumtoxin i livsmedel eller biologiska material (såsom blod, magsaft och kräkningar).
Vid sår botulism bekräftar däremot diagnosen serumtoxin eller isoleringen av Clostridium botulinum från ett hudläckprov detta.
